В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 19.09.2014 № 14.578.21.0055 с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на
- Изготовлены экспериментальные образцы биоинженерных конструкций на основе пористого СВМПЭ.
- Разработана Программа и методики испытаний экспериментальных образцов биоинженерных конструкций на основе пористого СВМПЭ.
- Проведены структурные исследования экспериментальных образцов биоинженерных конструкций на основе пористого СВМПЭ.
- Проведены испытания экспериментальных образцов биоинженерных конструкций на основе пористого СВМПЭ по Программе и методикам испытаний.
- Получены культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) млекопитающих.
- Подведены итоги этапа. Разработан промежуточный отчет о ПНИ.
- Проведено сравнительное изучение применения различных подходов для стерилизации экспериментальных образцов биоинженерных конструкций на основе пористого СВМПЭ.
- Исследована деконтаминированность экспериментальных образцов СВМПЭ с высокой пористостью после стерилизации в лабораторной установке.
- Отработана методика осаждения биоактивных покрытий с бактерицидным эффектом на поверхность сплошного армирующего слоя.
- Проведено изучение торможения роста колоний бактерий после коинкубации с экспериментальными образцами сплошного армирующего слоя.
- Отработана методика насыщения биоинженерных конструкций на основе пористого СВМПЭ белковыми факторами роста и/или ММСК.
При этом были получены следующие результаты:
- Проведено изготовление экспериментальных образцов биоинженерных конструкций на основе пористого СВМПЭ. Формируемые биоинженерные конструкции имитируют трубчатую кость. Пористый слой СВМПЭ имитирует губчатую ткань, а сплошной армирующий слой СВМПЭ кортикальную.
Рисунок 1 — Образцы пористого СВМПЭ
Рисунок 2 — Фотография сечения биоинженерной конструкции на основе СВМПЭ и её увеличенная часть с помощью СЭМ
- Полученные конструкции демонстрируют механическую прочность на сжатие. Слой пористого СВМПЭ прочно связан с армирующим слоем и не отделяется, не расслаивается при нагрузке. Полученные результаты свидетельствуют о высоких механических характеристиках биоинженерных конструкций на основе пористого СВМПЭ: предел прочности на сжатие более 70 МПа, модуль Юнга при сжатии более 1350 МПа. Механические свойства биоинженерных конструкций на основе пористого СВМПЭ близки к свойствам костной ткани.
Рисунок 3 — Фотография экспериментального образца биоинженерной конструкции на основе пористого СВМПЭ в разрезе после испытаний на сжатие
- Проведённые структурные исследования позволили установить, что в процессе получения биоинженерной конструкции не происходит окисления (термодеструкции) сплошного армирующего слоя.
- Получены культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), источником которой являлась спонгиозная масса костного мозга диафиза бедренных костей мышей линии C57BL/6J, в объеме 5 мл с концентрацией 460 000 клеток/мл, для последующего введения в биоинженерную конструкцию.
- Получены результаты изучения возможности применения различных подходов для стерилизации экспериментальных образцов биоинженерных конструкций на основе пористого СВМПЭ. Исследовалась стерилизация спиртом, сухим жаром, в автоклаве, а также при помощи лабораторной установки, разработанной на этапе 1. Показано, что оптимальным неразрушающим методом стерилизации, не приводящим к деструкции СВМПЭ, но эффективным, является метод стерилизации сверхкритическим диоксидом углерода при 200 атм, 40 оС в течение 15 мин с помощью лабораторной установки, разработанной на этапе 1.
- Получены результаты исследования деконтаминированности эксперименталь-ных образцов СВМПЭ с высокой пористостью после стерилизации в лабораторной установке. Полученные результаты анализа посевов экспериментальных образцов СВМПЭ с высокой пористостью, демонстрирующие отсутствие признаков колониеобразования как бактерий, так и грибов в специализированной питательной среде, свидетельствуют об отсутствии контаминации исследуемых образцов мик-рофлорой после стерилизующей обработки в лабораторной установке сверхкритическим диоксидом углерода.
- Проведены исследования торможения роста колоний бактерий после коинкубации с экспериментальными образцами сплошного армирующего слоя. Проведенные экспериментальные исследования позволили констатировать эффект торможения роста колоний грампозитивных и грамнегативных микроорганизмов различных видов (S.aureus, S. epidermidis, E. faecalis, B. subtilis, E.coli) после коинкубации с экспериментальными образцами сплошного армирующего слоя СВМПЭ. Поскольку основу активного покрытия составлял препарат амоксициллин, относимый к группе полусинтетических β-лактамных антибиотиков пенициллинового ряда с известным механизмом действия, то можно констатировать, что в результате работы, проведенной на данном этапе ПНИ, были созданы экспериментальные образцы сплошного армирующего слоя на основе СВМПЭ с бактерицидным покрытием.
Рисунок 4 — Учет результатов задержки колониеобразования бактерий вокруг экспериментального образца сплошного армирующего слоя с покрытием, контрольного (без покрытия) и стандартизированного диска) в проходящем свете
- Была отработана методика насыщения пористого слоя СВМПЭ ММСК и TGFβ/ММСК. Были определены оптимальные концентрации использования ММСК и TGFβ, обеспечивающие наиболее интенсивную пролиферацию. Так, для пористого образца СВМПЭ объёмом 1570 мм3 нагрузка ММСК должна составлять 6,4×105 клеток на 1 мм3 образца.
По основным результатам работ Этапа 2 можно заключить, что изготовленные экспериментальные образцы биоинженерных констукций на основе пористого СВМПЭ обладают оптимальным набором механических и структурных характеристик, наилучшим образом подходящих для создания нерезорбируемых костных имплантатов.
Предложенный метод обработки сверхкритическим диоксидом углерода позволяет эффективно проводить стерилизацию биоинженерных констукций, а разработанная методика нанесения биоактивного покрытия амоксициллина позволяет получать сплошной армирующий слой СВМПЭ с бактерицидным эффектом. Данный результат на подобной системе получен впервые, что является важным фактором новизны работы, а также соответствует мировому уровню. Предложенная методика насыщения биоинженерных конструкций на основе пористого СВМПЭ белковыми факторами роста и/или ММСК позволяет водить оптимальные концентрации, обеспечивающие наиболее интенсивную пролиферацию. Все заявленные требования в ТЗ на 2 этап выполнения ПНИ были полностью выполнены. Полученные в ходе выполнения ПНИ результаты будут являться основой для дальнейшего создания бислойных био-инженерных конструкций для репаративной хирургии плоских и трубчатых костей, с использованием ростовых факторов и клеточных технологий.
